高中植物组织培养实验的教学探究

王 飞（安徽省芜湖市安徽师范大学附属中学241000）

安徽省一等奖

摘要：针对人教版的高中生物学教材中的植物组织培养实验，介绍一种简便、适合高中生物学实验教学的山芋组织培养方法。详细介绍了母液、培养基的配制方法及配制和保存过程中的注意事项、各种激素的配方和培养基的配制中各个环节，从外植体的选取、清洗及接种各环节详细阐述了无菌营养物初代建立的关键技术。

关键词：植物组织培养 山芋 培养基 教学探究

目前，迅猛发展的生物技术已在农业、食品工业、医学、能源工业、环境保护等各个领域显示出极大的生产潜力，而作为其有力手段的组织培养，也日益受到重视。该技术是指在无菌操作的条件下，借助专门的培养基，离体培养植物的器官组织或细胞。利用植物组织培养技术，可以实现优良品种的快速繁殖大量不含病毒的幼苗；并可连续生产，缩短育种周期等^[1]。普通高中《生物课程标准》对本内容的具体标准是：尝试植物的组织培养。活动建议是：用组织培养法培养植物等幼苗，并进行露地栽培^[2,3]。

在高中新课程改革中倡导探究性学习，强调自主性学习，力图促进学生学习方式的变革，培养学生主动参与探究过程^[4,7]，为此，人教版的高中生物学新教材加入了植物组织培养实验，所用的材料是菊花或是月季^[5,6]。笔者经过多次试验，找出一种简便的，适合高中生物学教学的培养方法，采用山芋进行组培。希望通过本实验的探究，引起学生广泛的兴趣，能对高中生物学实验——植物组织培养提供一些指导性的建议。

1.实验材料

在市场上选取5、6个山芋，放在花盆中进行沙培，培养温度为25℃，两周后，长出山芋幼苗，将带有芽的山芋茎段（大约1～2cm）作为外植体。

2．实验方法

2.1灭菌与消毒

将分装有培养基的五只大锥形瓶、25只体积为100 mL的小锥形瓶和接种有关器具（接种用的镊子、接种针、培养皿及牛皮纸等）放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌。

2.2母液的配制

2.2.1MS培养基母液的配制

用于植物组织培养的培养基也叫MS固体培养基，该培养基中含有20多种营养成分，包括大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。为了避免每次配制时都要称量各成分，可先将各种成分按比例配制成浓缩液（大量元素浓缩10倍，微量元素、铁盐及有机物质都浓缩100倍）制成培养基母液（见表1）。母液放于-4℃冰箱中保存备用。

表1 MS培养基母液的配制

需要注意的是，大量元素中的氯化钙和铁盐中的硫酸亚铁不能与母液混合，否则会生成沉淀物，以致母液失效，配制时需单独装瓶贮存。

2.2.2植物激素母液的配制

除了上述四种母液外，培养基中经常添加的各种植物激素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。生长素类常用的如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)等，细胞分裂素类常用的如6-苄基嘌呤(6-BA)和激动素(KT)等。由于它们大多难溶于水，因此配制方法也各不相同。本次实验我们使用了2，4-D和6-BA，各自配制母液方法如下：①2，4-D准确称取10 mg，先用2 mL 95%的乙醇溶解，然后加水定容至100 mL，浓度为0.1 mg/mL，放置-4℃冰箱内贮存备用。②6-BA准确称取10 mg，先用2 mL的1 mol/L盐酸或氢氧化钠溶解，然后加水定容至100 mL，浓度为0.1 mg/mL，放置-4℃冰箱内贮存备用。

2.3固体培养基的配制

取1000 mL烧杯一只，加大量元素10倍母液100 mL，微量元素100倍母液10 mL，铁盐100倍母液10 mL，有机物质100倍母液10 mL，蔗糖30 g，然后加水至1000 mL，待蔗糖充分溶解后用1 mol/L盐酸或氢氧化钠调节pH为6.0，加入琼脂条8 g。最后将烧杯放在电炉上加热，并不断用玻璃棒搅拌，待琼脂完全融化后，停止加热，加水定容至1000 mL。冷却后将培养基分装于五只大锥形瓶中，每瓶200 mL。

本实验为了进一步探究出适合山芋芽愈伤组织形成的激素浓度，共进行了五组实验，每组五个重复组。具体方法是将五只大锥形瓶标记为A、B、C、D、E五组，A、B、C、D组都添加等量的2，4-D（0.1 mg/mL）和6-BA（0.1 mg/mL）。A组各添加1 mL，B组各添加2 mL，C组各添加3 mL，D组各添加4 mL，E组作为空白对照不添加任何激素，各组激素浓度见表2。最后将每组培养基分别分装到5只小锥形瓶中，每只约装40 mL培养基，用灭过菌的牛皮纸封住瓶口，并扎好橡皮筋。待培养基冷却凝固后接种。

表2 实验组别及激素浓度

2.4无菌培养的建立

2.4.1外植体的选取

用饱满而未萌发的山芋侧芽作为外植体，以枝条中段芽最好。

2.4.2清洗外植体

用流水冲洗外植体20分钟，放入体积分数为70%的酒精中消毒10s，取出用无菌水清洗。然后放人质量分数为0.1%的HgCl₂中消毒5分钟，取出后用无菌水清洗5次。在用无菌水冲洗时,为防止外植体随水流出烧杯,可以用纱布挡一下。

2.4.3接种

清理超净工作台上物品，打开鼓风机和紫外灯，后关闭紫外灯,用酒精棉球仔细擦拭超净工作台。将清洗好的茎段用消毒液浸泡，期间需不断搅拌液体，并要保证外植体全部浸没在消毒液中，且不断震荡，使外植体与消毒液充分接触。用无菌水冲洗数遍。然后严格按无菌操作要求，将茎段接种到三角瓶里,每瓶接3～5个。从芽萌发到芽长到1cm左右需要一周。

2.5继代增殖

3周后，将上述无菌芽从原茎段上切下，转接到的表2中的培养基上，观察嫩茎长出侧芽情况，并将原茎段弃去，统计计算。

2.6生根培养

将无菌芽转接到生根培养基上，16～21d，在嫩茎基部有根长出。

2.7培养条件

温度25士2℃，光照12h/d,光强3000 lx。

3.实验结果

E组未形成愈伤组织，A组、B组、C组和D组形成了明显的愈伤组织。其中C组、D组最先诱导出愈伤组织，并且愈伤组织也长得最好（见图1）。山芋嫩枝的侧芽约3周后侧芽长到1cm。这些无菌侧芽在培养基中继代增殖，约每4周平均每个芽能增殖到5个左右，在生根培养基中半个月就能长出3～5条根。每组都有少数外植体被杂菌污染。结果显示：2，4-D和6-BA浓度为1.5～2.0mg/L最适宜。

4.讨论

植物组织培养实验对培养基的要求很高，如营养物质要全面，pH和渗透压要合理等。可以通过实验来比较利用不同的实验材料对实验结果的影响，以及比较使用不同浓度的植物激素对实验结果的影响等。力求得出一些数据和结论，从而为学校今后开展植物组织培养实验提供便利条件。同时，在实际教学中可以促进学生主动学习探究，激发学生对生物学的学习热情。

参考文献

[1]潘瑞炽,董愚得.植物生理学.高等教育出版社.1995, 180～203.

[2]中华人民共和国教育部制订.普通高中生物课程标准（实验）.人民教育出版社.2003. 25～26.

[3]施忆. 高中生物课程标准中的活动与探究（选修部分）.高等教育出版社.2003. 91～100.

[4]生物课程教材研究开发中心编著.生物选修1：生物技术实践.人民教育出版社.2007. 32～36.

[5]生物课程教材研究开发中心编著.生物选修1：生物技术实践教师教学用书.人民教育出版社.2007. 22～25.

[6]生物课程教材研究开发中心编著.生物选修3：现代生物科技专题.人民教育出版社.2007. 34～35.

[7]生物课程教材研究开发中心编著.生物选修3：现代生物科技专题教师教学用书.人民教育出版社.2007. 35～36.